Tiere und Behandlung
Sechzig weibliche C57BL/6 N-Mäuse (Orient Bio, Seoul, Südkorea) wurden ab einem Alter von 3 Wochen mit einem 12:12-Hell-Dunkel-Zyklus und Nahrung und Wasser nach Belieben gehalten. Die Mäuse wurden zufällig in zwei Gruppen eingeteilt (n = 30 je) je nach Art der erhaltenen Nahrung: entweder eine Chow- (CHOW) oder eine 60% fettreiche (HF) Diät. CHOW-Mäuse wurden wiederum wie folgt in drei Gruppen eingeteilt: (1) LET-Gruppe, umfassend mit Letrozol behandelte Mäuse mit Nahrung, die nach Belieben verfügbar war (n = 10), (2) CON-Gruppe bestehend aus Placebo-behandelten Mäusen mit frei verfügbarem Futter (n= 10) und (3) LET-TRF-Gruppe, bestehend aus mit Letrozol behandelten Mäusen, die im Alter von 6 bis 10 Wochen mit TRF behandelt wurden (n = 10). Konsequenterweise wurden mit HFD gefütterte Mäuse auch wie folgt in drei Gruppen eingeteilt: LET/HF, CON/HF und LET-TRF/HF (Abb. 1). Das Studienprotokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee des Labortierforschungszentrums des Korea University College of Medicine (KOREA-2020–0003) genehmigt. Alle Methoden wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften durchgeführt. Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den ARRIVE-Richtlinien durchgeführt (https://arriveguidelines.org).
Experimentelles Design der Studie. Weiblichen C57BL/6-Mäusen wurden im Alter von vier Wochen Pellets implantiert, die Letrozol oder Placebo enthielten. Im Alter von sechs Wochen setzte die Hälfte der mit Letrozol behandelten Mäuse ad libitum fort, während die andere Hälfte mit der zeitlich begrenzten Fütterung begann. Folglich wurden drei Gruppen erstellt: CON, LET und LET-TRF. Das Körpergewicht wurde während des gesamten Studienzeitraums zweimal pro Woche gemessen. Vaginale Abstriche wurden im Alter von 8 Wochen bis 10 Wochen genommen, um das Stadium des Östruszyklus zu beurteilen. Nach 2–3-wöchigem Training für diese Verfahren wurde eine serielle Blutentnahme aus der Schwanzspitze durchgeführt, um den LH-Puls im Alter von 10 Wochen zu messen. Die Mäuse wurden am Ende des Experiments eingeschläfert und Gewebe und Serum wurden zur Analyse gesammelt. Alle Experimente wurden in CHOW-Diät- und 60% HFD-Gruppen entsprechend der Art der an die Mäuse verfütterten Diät eingeteilt. CONKontrolle, LASSENmit Letrozol behandelt, HFVielfett-Diät, WoWochen.
Im Alter von 4 Wochen wurde den Mäusen ein Letrozol-Pellet (50 µg/Tag) (LET-, LET-TRF-, LET/HF- und LET-TRF/HF-Mäuse) oder ein Placebo-Kontrollpellet (CON und CON/HF) subkutan implantiert Mäuse). Letrozol-Pulver wurde von Fitzgerald (Acton, MA, USA) bezogen und kundenspezifische 60-Tage-Pellets mit kontinuierlicher Freisetzung wurden von Innovative Research of America (Sarasota, FL, USA) bezogen. Die LET-, LET/HF-, CON- und CON/HF-Mäuse wurden mit Nahrung und Wasser gehalten, die nach Belieben verfügbar waren; jedoch wurden sowohl LET-TRF- als auch LET-TRF/HF-Mäuse nach zweiwöchiger Letrozol-Pellet-Implantation mit TRF behandelt. Das TRF-Regime erlaubte den Mäusen, 4 h lang (ZT12–ZT16) eine normale Diät zu sich zu nehmen und für die restlichen 20 h zu fasten. Wasser war unter allen Bedingungen frei verfügbar. Während der Fütterungsperiode wurden keine Kalorienrestriktionen auferlegt. Die Menge der aufgenommenen Nahrung wurde täglich gemessen und das Körpergewicht der Mäuse im Alter von 4 bis 10 Wochen zweimal pro Woche verfolgt.
Beurteilung des Östruszyklus
Die Vaginalzytologie der Weibchen wurde täglich um ca. 09:00 Uhr untersucht, um das Stadium des Östruszyklus zu bestimmen, das durch mikroskopische Visualisierung des vorherrschenden Zelltyps in Vaginalepithelabstrichen bestimmt wurde, die am selben Tag 4–5 Wochen nach LET erhalten wurden oder Kontrollpelletimplantation über einen Zeitraum von 10 Tagen20. Der Prozentsatz der Diöstruszyklen über 10 Tage wurde zwischen den drei Gruppen verglichen.
Serielle Blutentnahme aus der Schwanzspitze zur Messung des LH-Pulses
Es wurden serielle Blutentnahmen aus der Schwanzspitze von Mäusen durchgeführt, um das Muster der pulsierenden LH-Sekretion, wie zuvor veröffentlicht, zu beurteilen21 mit leichten Modifikationen. Mäuse wurden ab einem Alter von 7 Wochen (3 Wochen nach der LET-Pellet-Implantation) zur Gewöhnung täglich für 5–10 min behandelt. Ab einem Alter von 10 Wochen (6 Wochen nach Pellet-Implantation) wurde immer dann, wenn bestätigt wurde, dass sich die Mäuse im Diöstrus-Stadium befanden, zwischen 9:00 Uhr und 12:00 Uhr eine serielle Probenahme durchgeführt. Kurz gesagt, die Schwanzspitze wurde abgeschnitten, und etwa 15 Minuten später wurden alle 5 Minuten serielle Blutproben für eine Gesamtdauer von 2 Stunden gesammelt. Für jede Probe wurden 3 μl Vollblut aus dem Schwanz pipettiert, mit 57 μl Assay-Puffer (0,2 % Rinderserumalbumin – 0,05 % Tween 20 – PBS, pH 7,5) gemischt und bis zur Lagerung bei –20 auf Eis gestellt °C. Die Tiere waren während der gesamten Dauer des Experiments wach und konnten sich zwischen den Probenahmesitzungen frei in ihren Heimkäfigen bewegen. Die LH-Spiegel wurden mit einem ultrasensitiven Maus- und Ratten-LH-Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) des University of Virginia Center for Research in Reproduction Ligand Assay and Analysis Core gemessen.
